sasava

Metaproteomics mikrobiċi: mill-ipproċessar tal-kampjuni, ġbir tad-dejta għall-analiżi tad-dejta

Wu Enhui, Qiao Liang*

Dipartiment tal-Kimika, Fudan University, Shanghai 200433, iċ-Ċina

 

 

 

Il-mikro-organiżmi huma relatati mill-qrib mal-mard u s-saħħa tal-bniedem. Kif tifhem il-kompożizzjoni tal-komunitajiet mikrobjali u l-funzjonijiet tagħhom hija kwistjoni ewlenija li teħtieġ li tiġi studjata b'mod urġenti. F'dawn l-aħħar snin, il-metaproteomics saret mezz tekniku importanti biex tistudja l-kompożizzjoni u l-funzjoni tal-mikro-organiżmi. Madankollu, minħabba l-kumplessità u l-eteroġeneità għolja tal-kampjuni tal-komunità mikrobjali, l-ipproċessar tal-kampjuni, l-akkwist tad-dejta tal-ispettrometrija tal-massa u l-analiżi tad-dejta saru t-tliet sfidi ewlenin li bħalissa qed jiffaċċjaw il-metaproteomics. Fl-analiżi tal-metaproteomics, ħafna drabi huwa meħtieġ li jiġi ottimizzat it-trattament minn qabel ta 'tipi differenti ta' kampjuni u jiġu adottati skemi ta 'separazzjoni, arrikkiment, estrazzjoni u liżi mikrobjali differenti. Simili għall-proteome ta 'speċi waħda, il-modi ta' akkwist tad-dejta tal-ispettrometrija tal-massa fil-metaproteomics jinkludu mod ta 'akkwist dipendenti fuq id-dejta (DDA) u mod ta' akkwist indipendenti mid-dejta (DIA). Il-mod ta 'akkwist tad-dejta DIA jista' jiġbor kompletament l-informazzjoni tal-peptide tal-kampjun u għandu potenzjal kbir ta 'żvilupp. Madankollu, minħabba l-kumplessità tal-kampjuni tal-metaproteome, l-analiżi tad-dejta DIA tagħha saret problema ewlenija li tfixkel il-kopertura profonda tal-metaproteomics. F'termini ta 'analiżi tad-dejta, l-iktar pass importanti huwa l-kostruzzjoni ta' database tas-sekwenza tal-proteini. Id-daqs u l-kompletezza tad-database mhux biss għandhom impatt kbir fuq in-numru ta 'identifikazzjonijiet, iżda jaffettwaw ukoll l-analiżi fuq l-ispeċi u l-livelli funzjonali. Fil-preżent, l-istandard tad-deheb għall-kostruzzjoni ta 'database ta' metaproteome hija database ta 'sekwenza ta' proteina bbażata fuq il-metaġenoma. Fl-istess ħin, il-metodu ta 'filtrazzjoni tad-database pubblika bbażat fuq tfittxija iterattiva ġie ppruvat ukoll li għandu valur prattiku qawwi. Mill-perspettiva ta 'strateġiji speċifiċi ta' analiżi tad-dejta, metodi ta 'analiżi tad-dejta DIA ċċentrata fuq peptidi okkupaw mainstream assolut. Bl-iżvilupp ta 'tagħlim fil-fond u intelliġenza artifiċjali, se jippromwovi ħafna l-eżattezza, il-kopertura u l-veloċità tal-analiżi tal-analiżi tad-dejta makroproteomika. F'termini ta 'analiżi bijoinformatika downstream, serje ta' għodod ta 'annotazzjoni ġew żviluppati f'dawn l-aħħar snin, li jistgħu jwettqu annotazzjoni ta' speċi fil-livell ta 'proteini, livell ta' peptide u livell ta 'ġeni biex jiksbu l-kompożizzjoni ta' komunitajiet mikrobjali. Meta mqabbla ma 'metodi omics oħra, l-analiżi funzjonali tal-komunitajiet mikrobiċi hija karatteristika unika tal-makroproteomics. Il-makroproteomika saret parti importanti mill-analiżi multi-omika tal-komunitajiet tal-mikrobi, u għad għandha potenzjal kbir ta 'żvilupp f'termini ta' fond ta 'kopertura, sensittività ta' skoperta u kompletezza tal-analiżi tad-dejta.

 

01Pretrattament tal-kampjun

Fil-preżent, it-teknoloġija tal-metaproteomics intużat ħafna fir-riċerka tal-mikrobijoma tal-bniedem, ħamrija, ikel, oċean, ħama attiva u oqsma oħra. Meta mqabbel mal-analiżi tal-proteome ta 'speċi waħda, it-trattament minn qabel tal-kampjun tal-metaproteome ta' kampjuni kumplessi jiffaċċja aktar sfidi. Il-kompożizzjoni mikrobjali fil-kampjuni attwali hija kumplessa, il-firxa dinamika ta 'abbundanza hija kbira, l-istruttura tal-ħajt taċ-ċelluli ta' tipi differenti ta 'mikro-organiżmi hija differenti ħafna, u l-kampjuni ħafna drabi jkun fihom ammont kbir ta' proteini ospitanti u impuritajiet oħra. Għalhekk, fl-analiżi tal-metaproteome, ħafna drabi huwa meħtieġ li jiġu ottimizzati tipi differenti ta 'kampjuni u jiġu adottati skemi ta' separazzjoni mikrobjali, arrikkiment, estrazzjoni u liżi differenti.

L-estrazzjoni ta 'metaproteomes mikrobjali minn kampjuni differenti għandha ċerti xebh kif ukoll xi differenzi, iżda bħalissa hemm nuqqas ta' proċess unifikat ta 'pre-ipproċessar għal tipi differenti ta' kampjuni ta 'metaproteome.

 

02 Akkwist tad-dejta tal-ispettrometrija tal-massa

Fl-analiżi tal-proteome shotgun, it-taħlita tal-peptidi wara t-trattament minn qabel hija l-ewwel separata fil-kolonna kromatografika, u mbagħad tidħol fl-ispettrometru tal-massa għall-akkwist tad-dejta wara l-jonizzazzjoni. Simili għall-analiżi tal-proteome ta 'speċi waħda, il-modi ta' akkwist tad-dejta tal-ispettrometrija tal-massa fl-analiżi tal-makroproteome jinkludu l-mod DDA u l-mod DIA.

 

Bl-iterazzjoni u l-aġġornament kontinwi tal-istrumenti tal-ispettrometrija tal-massa, strumenti tal-ispettrometrija tal-massa b'sensittività u riżoluzzjoni ogħla huma applikati għal metaproteome, u l-fond tal-kopertura tal-analiżi tal-metaproteome huwa wkoll imtejjeb kontinwament. Għal żmien twil, serje ta 'strumenti ta' spettrometrija tal-massa b'riżoluzzjoni għolja mmexxija minn Orbitrap intużaw ħafna fil-metaproteome.

 

Tabella 1 tat-test oriġinali turi xi studji rappreżentattivi dwar metaproteomics mill-2011 sal-preżent f'termini ta 'tip ta' kampjun, strateġija ta 'analiżi, strument ta' spettrometrija tal-massa, metodu ta 'akkwist, softwer ta' analiżi, u numru ta 'identifikazzjonijiet.

 

03Analiżi tad-dejta tal-ispettrometrija tal-massa

3.1 Strateġija ta' analiżi tad-dejta tad-DDA

3.1.1 Tiftix fil-Bażi tad-Dejta

3.1.2de novostrateġija ta' sekwenzar

3.2 Strateġija ta' analiżi tad-dejta tad-DIA

 

04Klassifikazzjoni tal-ispeċi u annotazzjoni funzjonali

Il-kompożizzjoni tal-komunitajiet mikrobiċi f'livelli tassonomiċi differenti hija waħda mill-oqsma ewlenin ta 'riċerka fir-riċerka tal-mikrobijoma. F'dawn l-aħħar snin, ġew żviluppati serje ta 'għodod ta' annotazzjoni biex jiġu annotati l-ispeċi fil-livell tal-proteini, il-livell tal-peptidi, u l-livell tal-ġeni biex tinkiseb il-kompożizzjoni ta 'komunitajiet mikrobjali.

 

L-essenza tal-annotazzjoni funzjonali hija li tqabbel is-sekwenza tal-proteina fil-mira mad-database tas-sekwenza tal-proteini funzjonali. Bl-użu tad-databases tal-funzjoni tal-ġeni bħal GO, COG, KEGG, eggNOG, eċċ., Jistgħu jsiru analiżi ta' annotazzjoni funzjonali differenti fuq proteini identifikati minn makroproteomi. Għodod ta 'annotazzjoni jinkludu Blast2GO, DAVID, KOBAS, eċċ.

 

05Sommarju u Outlook

Il-mikro-organiżmi għandhom rwol importanti fis-saħħa u l-mard tal-bniedem. F'dawn l-aħħar snin, il-metaproteomics saret mezz tekniku importanti biex tistudja l-funzjoni tal-komunitajiet tal-mikrobi. Il-proċess analitiku tal-metaproteomics huwa simili għal dak tal-proteomics ta 'speċi waħda, iżda minħabba l-kumplessità tal-oġġett ta' riċerka tal-metaproteomics, jeħtieġ li jiġu adottati strateġiji speċifiċi ta 'riċerka f'kull pass ta' analiżi, minn trattament minn qabel tal-kampjun, akkwist ta 'dejta għal analiżi tad-dejta. Fil-preżent, grazzi għat-titjib tal-metodi ta 'pretrattament, l-innovazzjoni kontinwa tat-teknoloġija tal-ispettrometrija tal-massa u l-iżvilupp mgħaġġel tal-bijoinformatika, il-metaproteomics għamlet progress kbir fil-fond tal-identifikazzjoni u l-ambitu tal-applikazzjoni.

 

Fil-proċess ta 'trattament minn qabel ta' kampjuni ta 'makroproteome, in-natura tal-kampjun għandha titqies l-ewwel. Kif tissepara l-mikro-organiżmi miċ-ċelloli u l-proteini ambjentali hija waħda mill-isfidi ewlenin li qed jiffaċċjaw il-makroproteomi, u l-bilanċ bejn l-effiċjenza tas-separazzjoni u t-telf tal-mikrobi huwa problema urġenti li għandha tiġi solvuta. It-tieni nett, l-estrazzjoni tal-proteini tal-mikro-organiżmi għandha tqis id-differenzi kkawżati mill-eteroġeneità strutturali ta 'batterji differenti. Kampjuni ta 'makroproteome fil-medda ta' traċċi jeħtieġu wkoll metodi speċifiċi ta 'pretrattament.

 

F'termini ta' strumenti tal-ispettrometrija tal-massa, l-istrumenti tal-ispettrometrija tal-massa mainstream għaddew minn tranżizzjoni minn spettrometri tal-massa bbażati fuq analizzaturi tal-massa Orbitrap bħal LTQ-Orbitrap u Q Exactive għal spettrometri tal-massa bbażati fuq analizzaturi tal-massa tal-ħin tat-titjira akkoppjati b'mobilità tal-joni bħal timsTOF Pro . Is-serje timsTOF ta 'strumenti b'informazzjoni dwar id-dimensjoni tal-mobbiltà tal-joni għandhom preċiżjoni għolja ta' skoperta, limitu ta 'skoperta baxxa, u ripetibbiltà tajba. Gradwalment saru strumenti importanti f'varjetà ta 'oqsma ta' riċerka li jeħtieġu skoperta ta 'spettrometrija tal-massa, bħall-proteome, metaproteome, u metabolome ta' speċi waħda. Ta 'min jinnota li għal żmien twil, il-firxa dinamika tal-istrumenti tal-ispettrometrija tal-massa illimitat il-fond tal-kopertura tal-proteini tar-riċerka tal-metaproteome. Fil-futur, strumenti tal-ispettrometrija tal-massa b'firxa dinamika akbar jistgħu jtejbu s-sensittività u l-eżattezza tal-identifikazzjoni tal-proteini fil-metaproteomes.

 

Għall-akkwist tad-dejta tal-ispettrometrija tal-massa, għalkemm il-mod ta 'akkwist tad-dejta DIA ġie adottat b'mod wiesa' fil-proteome ta 'speċi waħda, il-biċċa l-kbira tal-analiżi tal-makroproteome attwali għadhom jużaw il-mod ta' akkwist tad-dejta DDA. Il-mod ta 'akkwist tad-dejta DIA jista' jikseb bis-sħiħ l-informazzjoni tal-jone tal-framment tal-kampjun, u meta mqabbel mal-mod ta 'akkwist tad-dejta DDA, għandu l-potenzjal li jikseb bis-sħiħ l-informazzjoni tal-peptide tal-kampjun tal-makroproteome. Madankollu, minħabba l-kumplessità għolja tad-dejta DIA, l-analiżi tad-dejta tal-makroproteome DIA għadha qed tiffaċċja diffikultajiet kbar. L-iżvilupp ta 'intelliġenza artifiċjali u tagħlim profond huwa mistenni li jtejjeb l-eżattezza u l-kompletezza tal-analiżi tad-dejta DIA.

 

Fl-analiżi tad-dejta tal-metaproteomics, wieħed mill-passi ewlenin huwa l-kostruzzjoni ta 'database tas-sekwenza tal-proteini. Għal oqsma ta 'riċerka popolari bħall-flora intestinali, jistgħu jintużaw databases tal-mikrobi intestinali bħal IGC u HMP, u nkisbu riżultati ta' identifikazzjoni tajba. Għall-biċċa l-kbira tal-analiżi tal-metaproteomics oħra, l-aktar strateġija effettiva ta 'kostruzzjoni ta' database għadha li tiġi stabbilita database ta 'sekwenza ta' proteina speċifika għal kampjun ibbażata fuq data ta 'sekwenzjar metaġenomika. Għal kampjuni tal-komunità mikrobjali b'kumplessità għolja u firxa dinamika kbira, huwa meħtieġ li jiżdied il-fond tas-sekwenzjar biex tiżdied l-identifikazzjoni ta 'speċi b'abbundanza baxxa, u b'hekk tittejjeb il-kopertura tad-database tas-sekwenza tal-proteini. Meta d-dejta tas-sekwenzjar tkun nieqsa, jista’ jintuża metodu ta’ tfittxija iterattiv biex tiġi ottimizzata d-database pubblika. Madankollu, it-tfittxija iterattiva tista 'taffettwa l-kontroll tal-kwalità tal-FDR, għalhekk ir-riżultati tat-tfittxija jeħtieġ li jiġu ċċekkjati bir-reqqa. Barra minn hekk, l-applikabilità ta 'mudelli tradizzjonali ta' kontroll tal-kwalità FDR fl-analiżi tal-metaproteomics għadha ta 'min jesploraha. F'termini ta 'strateġija ta' tfittxija, l-istrateġija tal-librerija spettrali ibrida tista 'ttejjeb il-fond tal-kopertura tal-metaproteomics DIA. F'dawn l-aħħar snin, il-librerija spettrali mbassra ġġenerata bbażata fuq tagħlim fil-fond uriet prestazzjoni superjuri fil-proteomika DIA. Madankollu, id-databases tal-metaproteome ħafna drabi jkun fihom miljuni ta 'daħliet ta' proteini, li jirriżultaw fi skala kbira ta 'libreriji spettrali mbassra, jikkonsma ħafna riżorsi tal-kompjuters, u jirriżulta fi spazju kbir ta' tfittxija. Barra minn hekk, ix-xebh bejn is-sekwenzi tal-proteini fil-metaproteomes ivarja ħafna, u jagħmilha diffiċli biex tiġi żgurata l-eżattezza tal-mudell ta 'previżjoni tal-librerija spettrali, għalhekk il-libreriji spettrali mbassra ma ntużawx ħafna fil-metaproteomics. Barra minn hekk, jeħtieġ li jiġu żviluppati strateġiji ġodda ta 'inferenza ta' proteini u annotazzjoni ta 'klassifikazzjoni biex japplikaw għall-analiżi metaproteomika ta' proteini simili ħafna ta 'sekwenza.

 

Fil-qosor, bħala teknoloġija emerġenti tar-riċerka tal-mikrobijoma, it-teknoloġija tal-metaproteomics kisbet riżultati ta 'riċerka sinifikanti u għandha wkoll potenzjal ta' żvilupp enormi.


Ħin tal-post: Awissu-30-2024