Il-kromatografija likwida hija l-metodu ewlieni għall-ittestjar tal-kontenut ta 'kull komponent u impuritajiet fil-materja prima, intermedji, preparazzjonijiet u materjali tal-ippakkjar, iżda ħafna sustanzi m'għandhomx metodi standard biex jiddependu fuqhom, għalhekk huwa inevitabbli li jiġu żviluppati metodi ġodda. Fl-iżvilupp ta 'metodi ta' fażi likwida, il-kolonna kromatografika hija l-qalba tal-kromatografija likwida, allura kif tagħżel kolonna kromatografika adattata hija kruċjali. F'dan l-artikolu, l-awtur se jispjega kif tagħżel kolonna tal-kromatografija likwida minn tliet aspetti: ideat ġenerali, kunsiderazzjonijiet u ambitu tal-applikazzjoni.
A.Ideat ġenerali għall-għażla tal-kolonni tal-kromatografija likwida
1. Evalwa l-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi ta 'l-analite: bħal struttura kimika, solubilità, stabbiltà (bħal jekk huwiex faċli li jiġi ossidizzat / imnaqqas / idrolizzat), aċidità u alkalinità, eċċ., speċjalment l-istruttura kimika hija ċ-ċavetta fattur fid-determinazzjoni tal-proprjetajiet, bħall-grupp konjugat għandu assorbiment ultravjola qawwi u fluworexxenza qawwija;
2. Iddetermina l-iskop tal-analiżi: jekk humiex meħtieġa separazzjoni għolja, effiċjenza għolja fil-kolonna, ħin qasir ta 'analiżi, sensittività għolja, reżistenza għal pressjoni għolja, ħajja twila ta' kolonna, prezz baxx, eċċ;
- Agħżel kolonna kromatografika adattata: tifhem il-kompożizzjoni, il-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi tal-mili kromatografiku, bħad-daqs tal-partiċelli, id-daqs tal-pori, it-tolleranza tat-temperatura, it-tolleranza tal-pH, l-adsorbiment tal-analite, eċċ.
- Konsiderazzjonijiet għall-għażla tal-kolonni tal-kromatografija likwida
Dan il-kapitolu ser jiddiskuti l-fatturi li għandhom jiġu kkunsidrati meta tagħżel kolonna tal-kromatografija mill-perspettiva tal-proprjetajiet fiżiċi u kimiċi tal-kolonna tal-kromatografija nnifisha. 2.1 Matriċi tal-mili
2.1.1 Matriċi tal-ġel tas-silika Il-matriċi tal-mili tal-biċċa l-kbira tal-kolonni tal-kromatografija likwida hija ġel tas-silika. Dan it-tip ta 'mili għandu purità għolja, spiża baxxa, saħħa mekkanika għolja, u huwa faċli biex timmodifika gruppi (bħal twaħħil tal-fenil, twaħħil amino, twaħħil cyano, eċċ.), iżda l-valur tal-pH u l-firxa tat-temperatura li jittollera huma limitati: il- Il-firxa tal-pH tal-biċċa l-kbira tal-mili tal-matriċi tal-ġel tas-silika hija 2 sa 8, iżda l-firxa tal-pH ta 'fażijiet imwaħħla b'ġel tas-silika modifikati apposta tista' tkun wiesgħa daqs 1.5 sa 10, u hemm ukoll fażijiet imwaħħla b'ġel tas-silika modifikati apposta li huma stabbli f'pH baxx, bħal Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, li huwa stabbli f'pH 1 sa 8; il-limitu ta 'fuq tat-temperatura tal-matriċi tal-ġel tas-silika huwa normalment 60 ℃, u xi kolonni tal-kromatografija jistgħu jittolleraw temperatura ta' 40 ℃ f'pH għoli.
2.1.2 Polimer matrix Il-mili tal-polimeru huma l-aktar polystyrene-divinylbenzene jew polymethacrylate. Il-vantaġġi tagħhom huma li jistgħu jittolleraw firxa wiesgħa ta 'pH - jistgħu jintużaw fil-medda ta' 1 sa 14, u huma aktar reżistenti għal temperaturi għoljin (jistgħu jilħqu 'l fuq minn 80 °C). Meta mqabbel ma 'fillers C18 bbażati fuq is-silika, dan it-tip ta' mili għandu idrofobiċità aktar b'saħħitha, u l-polimeru makroporuż huwa effettiv ħafna fis-separazzjoni ta 'kampjuni bħal proteini. L-iżvantaġġi tiegħu huma li l-effiċjenza tal-kolonna hija aktar baxxa u s-saħħa mekkanika hija aktar dgħajfa minn dik tal-mili bbażati fuq is-silika. 2.2 Forma tal-partiċelli
Ħafna mill-mili tal-HPLC moderni huma partiċelli sferiċi, iżda xi kultant huma partiċelli irregolari. Partiċelli sferiċi jistgħu jipprovdu pressjoni tal-kolonna aktar baxxa, effiċjenza ogħla tal-kolonna, stabbiltà u ħajja itwal; meta tuża fażijiet mobbli ta 'viskożità għolja (bħal aċidu fosforiku) jew meta s-soluzzjoni tal-kampjun tkun viskuża, partiċelli irregolari għandhom erja tal-wiċċ speċifika akbar, li twassal aktar għall-azzjoni sħiħa taż-żewġ fażijiet, u l-prezz huwa relattivament baxx. 2.3 Daqs tal-partiċelli
Iktar ma jkun żgħir id-daqs tal-partiċelli, iktar tkun għolja l-effiċjenza tal-kolonna u iktar tkun għolja s-separazzjoni, iżda iktar tkun agħar ir-reżistenza għall-pressjoni għolja. L-iktar kolonna użata b'mod komuni hija l-kolonna tad-daqs tal-partiċelli ta '5 μm; jekk ir-rekwiżit ta 'separazzjoni huwa għoli, jista' jintgħażel mili ta '1.5-3 μm, li jwassal biex issolvi l-problema ta' separazzjoni ta 'xi matriċi kumplessa u kampjuni b'ħafna komponenti. UPLC jista 'juża fillers ta' 1.5 μm; Fillers ta 'daqs ta' partiċelli ta '10 μm jew akbar ħafna drabi jintużaw għal kolonni semi-preparattivi jew preparattivi. 2.4 Kontenut tal-karbonju
Il-kontenut tal-karbonju jirreferi għall-proporzjon tal-fażi magħquda fuq il-wiċċ tal-ġel tas-silika, li hija relatata mal-erja tal-wiċċ speċifika u l-kopertura tal-fażi marbuta. Kontenut għoli ta 'karbonju jipprovdi kapaċità ta' kolonna għolja u riżoluzzjoni għolja, u ħafna drabi jintuża għal kampjuni kumplessi li jeħtieġu separazzjoni għolja, iżda minħabba l-ħin ta 'interazzjoni twil bejn iż-żewġ fażijiet, il-ħin tal-analiżi huwa twil; Kolonni kromatografiċi b'kontenut baxx ta 'karbonju għandhom ħin ta' analiżi iqsar u jistgħu juru selettività differenti, u ħafna drabi jintużaw għal kampjuni sempliċi li jeħtieġu analiżi rapida u kampjuni li jeħtieġu kundizzjonijiet ta 'fażi akweja għolja. Ġeneralment, il-kontenut tal-karbonju ta 'C18 ivarja minn 7% sa 19%. 2.5 Id-daqs tal-pori u l-erja tal-wiċċ speċifika
Il-midja ta 'assorbiment HPLC huma partiċelli porużi, u l-biċċa l-kbira tal-interazzjonijiet iseħħu fil-pori. Għalhekk, il-molekuli għandhom jidħlu fil-pori biex jiġu adsorbiti u separati.
Id-daqs tal-pori u l-erja tal-wiċċ speċifika huma żewġ kunċetti komplementari. Daqs żgħir tal-pori jfisser żona tal-wiċċ speċifika kbira, u viċi versa. Erja tal-wiċċ speċifika kbira tista 'żżid l-interazzjoni bejn il-molekuli tal-kampjun u l-fażijiet marbuta, ittejjeb iż-żamma, iżid it-tagħbija tal-kampjun u l-kapaċità tal-kolonna, u s-separazzjoni ta' komponenti kumplessi. Fillers kompletament porużi jappartjenu għal dan it-tip ta 'mili. Għal dawk b'rekwiżiti ta 'separazzjoni għolja, huwa rakkomandat li tagħżel fillers b'erja tal-wiċċ speċifika kbira; żona tal-wiċċ speċifika żgħira tista 'tnaqqas il-pressjoni ta' wara, ittejjeb l-effiċjenza tal-kolonna, u tnaqqas il-ħin tal-ekwilibriju, li huwa adattat għall-analiżi tal-gradjent. Fillers tal-qalba tal-qoxra jappartjenu għal dan it-tip ta 'fillers. Fuq il-premessa li tiġi żgurata s-separazzjoni, huwa rakkomandat li tagħżel fillers b'erja tal-wiċċ speċifika żgħira għal dawk b'rekwiżiti ta 'effiċjenza għolja ta' analiżi. 2.6 Volum tal-pori u saħħa mekkanika
Il-volum tal-pori, magħruf ukoll bħala "volum tal-pori", jirreferi għad-daqs tal-volum vojt għal kull partikula unità. Jista 'jirrifletti sew is-saħħa mekkanika tal-mili. Is-saħħa mekkanika tal-mili b'volum kbir ta 'pori hija kemxejn aktar dgħajfa minn dik ta' mili b'volum żgħir ta 'pori. Fillers b'volum tal-pori inqas minn jew ugwali għal 1.5 mL/g jintużaw l-aktar għas-separazzjoni HPLC, filwaqt li fillers b'volum tal-pori akbar minn 1.5 mL/g jintużaw prinċipalment għall-kromatografija ta 'esklużjoni molekulari u kromatografija bi pressjoni baxxa. 2.7 Rata ta' limitu massimu
Il-limitu jista 'jnaqqas il-qċaċet tat-tailing ikkawżati mill-interazzjoni bejn il-komposti u l-gruppi silanol esposti (bħal twaħħil joniku bejn komposti alkalini u gruppi silanol, forzi van der Waals u bonds idroġenu bejn komposti aċidużi u gruppi silanol), u b'hekk itejbu l-effiċjenza tal-kolonna u l-għamla tal-quċċata . Fażijiet magħqudin mingħajr limitu se jipproduċu selettività differenti relattivi għal fażijiet magħqudin b'kappa, speċjalment għal kampjuni polari.
- Skop ta 'applikazzjoni ta' kolonni ta 'kromatografija likwida differenti
Dan il-kapitolu ser jiddeskrivi l-ambitu tal-applikazzjoni ta 'tipi differenti ta' kolonni tal-kromatografija likwida permezz ta 'xi każijiet.
3.1 Kolonna kromatografika C18 b'fażi inversa
Il-kolonna C18 hija l-kolonna tal-fażi maqluba l-aktar użata b'mod komuni, li tista 'tissodisfa t-testijiet tal-kontenut u l-impurità tal-biċċa l-kbira tas-sustanzi organiċi, u hija applikabbli għal sustanzi polari medja, polari dgħajjef u mhux polari. It-tip u l-ispeċifikazzjoni tal-kolonna kromatografika C18 għandhom jintgħażlu skont ir-rekwiżiti speċifiċi tas-separazzjoni. Pereżempju, għal sustanzi b'rekwiżiti ta 'separazzjoni għolja, spiss jintużaw speċifikazzjonijiet ta' 5 μm * 4.6 mm * 250 mm; għal sustanzi b'matriċi ta 'separazzjoni kumplessa u polarità simili, jistgħu jintużaw speċifikazzjonijiet ta' 4 μm * 4.6 mm * 250 mm jew daqsijiet ta 'partiċelli iżgħar. Pereżempju, l-awtur uża kolonna ta '3 μm * 4.6 mm * 250 mm biex jiskopri żewġ impuritajiet ġenotossiċi f'celecoxib API. Is-separazzjoni taż-żewġ sustanzi tista 'tilħaq 2.9, li hija eċċellenti. Barra minn hekk, taħt il-premessa li tiġi żgurata s-separazzjoni, jekk tkun meħtieġa analiżi rapida, ħafna drabi tintgħażel kolonna qasira ta '10 mm jew 15 mm. Pereżempju, meta l-awtur uża LC-MS/MS biex jikxef impurità ġenotossika fl-API tal-fosfat piperaquine, intużat kolonna ta '3 μm * 2.1 mm * 100 mm. Is-separazzjoni bejn l-impurità u l-komponent ewlieni kienet 2.0, u l-iskoperta ta 'kampjun tista' titlesta f'5 minuti. 3.2 Kolonna tal-fenil b'fażi inversa
Kolonna tal-fenil hija wkoll tip ta 'kolonna b'fażi inversa. Dan it-tip ta 'kolonna għandu selettività qawwija għal komposti aromatiċi. Jekk ir-rispons ta 'komposti aromatiċi mkejla minn kolonna C18 ordinarja hija dgħajfa, tista' tikkunsidra li tissostitwixxi l-kolonna tal-fenil. Pereżempju, meta kont qed nagħmel celecoxib API, ir-rispons tal-komponent ewlieni mkejjel mill-kolonna tal-fenil tal-istess manifattur u l-istess speċifikazzjoni (il-5 μm * 4.6 mm * 250 mm kollha) kien madwar 7 darbiet dak tal-kolonna C18. 3.3 Kolonna tal-fażi normali
Bħala suppliment effettiv għall-kolonna ta 'fażi inversa, kolonna ta' fażi normali hija adattata għal komposti polari ħafna. Jekk il-quċċata tkun għadha mgħaġġla ħafna meta l-elużjoni b'aktar minn 90% fażi akwea fil-kolonna tal-fażi maqluba, u anke qrib u tikkoinċidi mal-quċċata tas-solvent, tista 'tikkunsidra li tissostitwixxi l-kolonna tal-fażi normali. Dan it-tip ta 'kolonna jinkludi kolonna hilic, kolonna amino, kolonna cyano, eċċ.
3.3.1 Kolonna Hilic Kolonna Hilic normalment tinkorpora gruppi idrofiliċi fil-katina tal-alkil magħquda biex ittejjeb ir-rispons għal sustanzi polari. Dan it-tip ta 'kolonna huwa adattat għall-analiżi tas-sustanzi taz-zokkor. L-awtur uża dan it-tip ta 'kolonna meta għamel il-kontenut u s-sustanzi relatati ta' xylose u d-derivattivi tiegħu. L-isomeri ta 'derivattiv xylose jistgħu wkoll ikunu separati sew;
3.3.2 Kolonna amino u kolonna cyano Kolonna amino u kolonna cyano jirreferu għall-introduzzjoni ta 'modifiki amino u cyano fl-aħħar tal-katina tal-alkil magħquda, rispettivament, biex titjieb is-selettività għal sustanzi speċjali: per eżempju, kolonna amino hija għażla tajba għas-separazzjoni ta' zokkor, aċidi amminiċi, bażijiet, u amidi; Kolonna cyano għandha selettività aħjar meta tissepara sustanzi strutturali simili idroġenati u mhux idroġenati minħabba l-preżenza ta 'bonds konjugati. Il-kolonna amino u l-kolonna cyano ta 'spiss jistgħu jinqalbu bejn il-kolonna tal-fażi normali u l-kolonna tal-fażi inversa, iżda swiċċjar frekwenti mhuwiex rakkomandat. 3.4 Kolonna kirali
Kolonna kirali, kif tissuġġerixxi l-isem, hija adattata għas-separazzjoni u l-analiżi ta 'komposti kirali, speċjalment fil-qasam tal-farmaċewtiċi. Dan it-tip ta 'kolonna jista' jiġi kkunsidrat meta kolonni konvenzjonali ta 'fażi inversa u fażi normali ma jistgħux jiksbu s-separazzjoni tal-isomeri. Pereżempju, l-awtur uża kolonna kirali ta '5 μm * 4.6 mm * 250 mm biex jissepara ż-żewġ isomeri ta' 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S) -1, 2-diphenylethylenediamine u (1R, 2R) -1, 2 -diphenylethylenediamine, u s-separazzjoni bejn it-tnejn laħqet madwar 2.0. Madankollu, kolonni kirali huma aktar għaljin minn tipi oħra ta 'kolonni, ġeneralment 1W +/biċċa. Jekk ikun hemm bżonn ta' kolonni bħal dawn, l-unità trid tagħmel baġit suffiċjenti. 3.5 Kolonna ta' skambju joniku
Kolonni ta 'skambju joniku huma adattati għas-separazzjoni u l-analiżi ta' joni ċċarġjati, bħal joni, proteini, aċidi nuklejċi, u xi sustanzi taz-zokkor. Skond it-tip ta 'mili, huma maqsuma f'kolonni ta' skambju ta 'katjoni, kolonni ta' skambju ta 'anjoni, u kolonni ta' skambju ta 'katjoni qawwija.
Kolonni ta 'skambju katjoniku jinkludu kolonni bbażati fuq il-kalċju u bbażati fuq l-idroġenu, li huma prinċipalment adattati għall-analiżi ta' sustanzi katjoniċi bħal aċidi amminiċi. Pereżempju, l-awtur uża kolonni bbażati fuq il-kalċju meta janalizza glukonat tal-kalċju u aċetat tal-kalċju f'soluzzjoni ta 'flushing. Iż-żewġ sustanzi kellhom risponsi qawwija f'λ=210nm, u l-grad ta 'separazzjoni laħaq 3.0; l-awtur uża kolonni bbażati fuq l-idroġenu meta janalizza sustanzi relatati mal-glukożju. Diversi sustanzi maġġuri relatati – maltose, maltotriose u fruttosju – kellhom sensittività għolja taħt ditekters differenzjali, b'limitu ta 'skoperta baxx daqs 0.5 ppm u grad ta' separazzjoni ta '2.0-2.5.
Kolonni ta 'skambju anjoniku huma prinċipalment adattati għall-analiżi ta' sustanzi anjoniċi bħal aċidi organiċi u joni aloġenu; kolonni b'saħħithom ta 'skambju ta' katjoni għandhom kapaċità u selettività ogħla ta 'skambju joniku, u huma adattati għas-separazzjoni u l-analiżi ta' kampjuni kumplessi.
Dan ta 'hawn fuq huwa biss introduzzjoni għat-tipi u l-firxiet ta' applikazzjoni ta 'diversi kolonni ta' kromatografija likwida komuni flimkien mal-esperjenza tal-awtur stess. Hemm tipi speċjali oħra ta 'kolonni kromatografiċi f'applikazzjonijiet attwali, bħal kolonni kromatografiċi b'pori kbar, kolonni kromatografiċi b'pori żgħar, kolonni kromatografiċi ta' affinità, kolonni kromatografiċi multimodali, kolonni kromatografiċi likwidi ta 'prestazzjoni ultra-għolja (UHPLC), kolonni kromatografiċi ta' fluwidu superkritiku ( SFC), eċċ. Huma għandhom rwol importanti f'oqsma differenti. It-tip speċifiku ta 'kolonna kromatografika għandu jintgħażel skond l-istruttura u l-proprjetajiet tal-kampjun, ir-rekwiżiti ta' separazzjoni u skopijiet oħra.
Ħin tal-post: Ġunju-14-2024